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HIBRIDIZAÇÃO IN SITU COM FLUORESCÊNCIA EM LÂMINAS PREVIAMENTE CORADAS DE CÉLULAS PLURIPOTENTES INDUZIDAS E DE LINHAGENS CELULARES IMORTALIZADAS

CHRISTONI, Gabriella Machado ¹; VAZ, Isadora May ³; JAMUR, Valderez Ravaglio ³; JAMUR, Valderez Ravaglio ³; BROFMAN, Paulo Roberto Slud ²
Curso do(a) Estudante: Ciências Biológicas – Bacharelado – Escola de Medicina e Ciências da Vida – Câmpus Curitiba
Curso do(a) Orientador(a): Medicina – Escola de Medicina e Ciências da Vida – Câmpus Curitiba

INTRODUÇÃO: As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são células somáticas que adquirem estado pluripotente através da reprogramação usando fatores de transcrição. A instabilidade genômica em células pluripotentes cultivadas é reportada há anos na literatura, sendo a indução à pluripotência associada à acumulação de anormalidades cromossômicas. Além disso, as linhagens celulares imortalizadas são amplamente utilizadas para o controle positivo de qualidade genômica em pesquisas citogenéticas, por possuírem cariótipos aberrantes bem definidos e pela alta capacidade de proliferação. No entanto, essas anormalidades podem não ser detectadas por citogenética clássica, devido à alta complexidade dos rearranjos presentes. Nesse contexto, a técnica de hibridização in situ (Fluorescence In Situ Hybridization – FISH) apresenta-se como uma das alternativas para a identificação dessas anormalidades. Em casos que a amostra foi esgotada, é necessário realizar a técnica em lâminas previamente bandeadas com tripsina e coradas com Giemsa (bandeamento GTG) para identificar as aberrações presentes nas metáfases analisadas por cariotipagem. OBJETIVOS: Estabelecer um protocolo de FISH para lâminas previamente coradas por bandeamento GTG. MATERIAIS E MÉTODO: Cinco amostras de células-tronco pluripotentes induzidas, doadas pelo Instituto Carlos Chagas (ICC), foram previamente analisadas por análise citogenética clássica. Em duas amostras foi observado material adicional no cromossomo 1. Para esclarecer esta alteração, foi realizada a técnica de FISH, utilizando-se da sonda tipo painting para o cromossomo 1. A técnica foi aplicada em lâminas de cada amostra, tanto frescas como bandeadas. Foram avaliados três protocolos distintos de descoloração das lâminas, com o objetivo de alcançar a melhor visualização dos sinais. Essa sonda também foi utilizada em cinco amostras de linhagens celulares imortalizadas, previamente coradas por bandeamento GTG, fornecidas pelo Laboratório para o Estudo de Toxinas e Câncer da PUCPR. Essas linhagens também exibiram alterações do cromossomo 1 na análise cromossômica. RESULTADOS: Os três protocolos demonstraram eficiência na remoção completa do corante e na preservação morfológica dos cromossomos, demonstrados pelo bom resultado de sinais da hibridização. Foi possível esclarecer que o material adicional presente no cromossomo 1 foi resultado da duplicação de um dos braços desse cromossomo, provavelmente do braço longo. Quanto as lâminas das linhagens celulares imortalizadas, as tentativas de hibridização da maioria resultaram em fluorescência de baixa qualidade, porém visíveis. Houve falha de hibridização em apenas uma, mesmo com o uso dos diversos protocolos de descoloração. CONSIDERAÇÕES FINAIS: Os três protocolos testados foram eficazes na preparação das lâminas para FISH, que se mostrou útil no esclarecimento da alteração presente nas metáfases.

PALAVRAS-CHAVE: Células-tronco pluripotentes induzidas; Hibridização in situ por fluorescência; Instabilidade genética; Cariótipo; Protocolo de descoloração.

APRESENTAÇÃO EM VÍDEO

Legendas:
  1. Estudante
  2. Orientador
  3. Colaborador
Esta pesquisa foi desenvolvida com bolsa CNPq no programa PIBIC.

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