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PADRONIZAÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE BIFIDOBACTERIUM SP. POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM TEMPO REAL

CALLIL, João Marcelo Lacreta ¹; TAVARES, Eliandro Reis ²
Curso do(a) Estudante: Medicina – Câmpus Londrina –
Curso do(a) Orientador(a): Medicina – Câmpus Londrina

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal exerce papel fundamental na manutenção da homeostase, modulando funções digestivas, imunológicas e neurocomportamentais. Dentre os gêneros bacterianos com maior relevância para a saúde humana, destaca-se Bifidobacterium, pertencente ao filo Actinobacteria, cuja presença está associada à integridade da barreira intestinal, efeitos anti-inflamatórios e produção de neurotransmissores como a dopamina. Por isso, métodos de detecção rápidos e específicos são essenciais para o monitoramento da abundância de Bifidobacterium na microbiota intestinal, permitindo identificar variações populacionais com maior precisão e superar as limitações de sensibilidade e tempo associadas às culturas microbiológicas convencionais. Neste cenário, a técnica de PCR em tempo real (qPCR) emerge como uma ferramenta molecular importante que pode ser aplicada nessas investigações. OBJETIVOS: Nesse sentido, objetivo geral foi desenvolver e padronizar um sistema baseado em qPCR para a detecção do gênero Bifidobacterium. Os objetivos específicos incluíram: análise in silico de sequências do gene 16S rRNA de espécies do gênero; desenho de oligonucleotídeos específicos; construção de controle positivo plasmidial sintético; e otimização do sistema de amplificação. MATERIAIS E MÉTODO: Foram coletadas 10 sequências do gene 16S rRNA correspondentes a 10 espécies de Bifidobacterium, no banco de dados GenBank. Após, as sequências foram alinhadas utilizando o algorítimo ClustalW e então deduzida uma sequência consenso usando o programa BioEdit. Os iniciadores foram desenhados com auxílio da ferramenta OligoAnalyzer, utilizando a sequência consenso. A sequência-alvo dos oligonucleotídeos iniciadores foi inserida no vetor pUC57 para construção do controle positivo plasmidial. A PCR convencional foi realizada para definir a temperatura de hibridação ideal. Para isso, as temperaturas testadas variaram de 50 °C a 60 ºC. Posteriormente, o sistema foi validado por qPCR utilizando o método de detecção SYBR Green em termociclador Rotor-Gene Q-Series 5PLEX-HRM. Em um volume final de 20 µL, contendo QuantiNovaTM SYBR® Green PCR kit, 1 μM de cada oligonucleotídeo iniciador e 106 cópias da construção sintética plasmidial. Uma curva de dissociação para determinar os picos de dissociação dos iniciadores foi obtida pelo aumento gradativo da temperatura em 0,5 ºC, entre os valores de 60 ºC e 99 ºC. Para validação do sistema de amplificação em amostras biológicas, foram utilizadas amostras fecais humanas de indivíduos com e sem diagnóstico de TDAH. Curvas de dissociação foram realizadas para análise de especificidade e confiabilidade. Os ensaios foram conduzidos de acordo com as recomendações do comitê de ética envolvendo seres humanos. RESULTADOS: A partir das temperaturas testadas, a temperatura de hibridação escolhida foi de 56 °C, aplicadas em todos os ensaios de qPCR. Os oligonucleotídeos específicos geraram amplicons de 102 pares de bases, com temperatura de dissociação (Tm) de 82,5 °C. Nas análises de amostras clínicas, Bifidobacterium foi detectado em 70% (7/10) das amostras do grupo controle e em 53,3% (8/15) do grupo com TDAH. CONSIDERAÇÕES FINAIS: A padronização de qPCR para Bifidobacterium demonstrou-se eficiente para a detecção tanto utilizando o controle sintético quanto em amostras biológicas. Além disso, os resultados sugerem uma possível correlação entre a menor abundância de Bifidobacterium e o TDAH. O método desenvolvido representa uma ferramenta promissora para futuras investigações em saúde mental e disbiose intestinal.

PALAVRAS-CHAVE: Bifidobacterium; Microbiota Intestinal; Qpcr; Disbiose; Eixo Cérebro-Intestino-Microbiota.

APRESENTAÇÃO EM VÍDEO

Legendas:
  1. Estudante
  2. Orientador
  3. Colaborador
Esta pesquisa foi desenvolvida com bolsa PUCPR no programa PIBIC.

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