PADRONIZAÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES PARA DETECÇÃO DE VEILLONELLA SP. POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM TEMPO REAL

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal desempenha papel central na manutenção da homeostase e na modulação de diversas funções fisiológicas, incluindo respostas imunes e processos neuropsiquiátricos. Entre os microrganismos que compõem esse ecossistema, o gênero Veillonella. A partir disso, a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) se apresenta como ferramenta promissora para detecção sensível e específica de microrganismos intestinais, permitindo a padronização de métodos para análises qualitativas e quantitativas da microbiota. OBJETIVOS: Neste projeto, o objetivo geral foi o desenvolvimento de um sistema baseado em PCR em tempo real para a detecção e quantificação do gênero Veillonella sp., componente da microbiota intestinal. Os objetivos específicos foram a busca e análise das sequências nucleotídicas in sílico; o desenho de um par de oligonucleotídeos específicos para Veillonella sp.; a construção um controle positivo plasmidial sintético; a padronização das condições do sistema de amplificação por PCR convencional; a padronização das condições do sistema de amplificação por PCR em tempo real. MATERIAIS E MÉTODO: Foram coletadas sequências do gene 16S rRNA de 10 espécies de Veillonella no GenBank. Após alinhamento por ClustalW e geração de sequência-consenso pelo BioEdit, oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados com auxílio da ferramenta OligoAnalyzer. Para garantir a viabilidade da reação, um controle positivo sintético foi construído ao inserir a sequência correspondente ao amplicon em um plasmídeo pUC57. A padronização ocorreu em duas etapas metodológicas: primeiro, uma PCR convencional com gradiente de temperatura de hibridação (52°C a 62°C) foi executada para otimizar a temperatura desta etapa. Em seguida, as condições otimizadas foram transferidas e validadas por qPCR em um termociclador Rotor-Gene Q-series 5PLEX-HRM, em um volume final de 20 µL, contendo QuantiNovaTM SYBR® Green PCR kit (Qiagen), 1 μM de cada oligonucleotídeo iniciador e 106 cópias da construção sintética plasmidial. Uma curva de dissociação para determinar os picos de dissociação dos iniciadores foi obtida pelo aumento gradativo da temperatura em 0,5 ºC, entre os valores de 60 ºC e 99 ºC. Para validação dos iniciadores em amostras biológicas, 25 amostras de fezes foram utilizadas para purificação do material genético que, por sua vez, foram usados em amplificação por PCR. RESULTADOS: Após a otimização de amplificação, a temperatura de hibridação dos iniciadores escolhida foi de 56 ºC. Alem disso, após a análise da curva de dissociação para Veillonella, os resultados apresentaram o pico de temperatura de dissociação (Tm) de 83,7 °C. Das 25 amostras biológicas testadas, 14 delas foram positivas para a presença de Veillonella. CONSIDERAÇÕES FINAIS: A padronização do sistema de qPCR para Veillonella demonstrou-se eficiente, sendo capaz de detectar esse gênero bacteriano em amostras biológicas com alta confiabilidade. O método desenvolvido poderá ser utilizado em futuras investigações clínicas envolvendo a análise do microbioma intestinal.

PALAVRAS-CHAVE: Oligonucleotídeos iniciadores; Veillonella spp.; PCR em tempo real.