PADRONIZAÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES PARA DETECÇÃO DE ENTEROCOCCUS SP. POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM TEMPO REAL

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal desempenha papel central na manutenção da homeostase e na modulação de diversas funções fisiológicas, incluindo respostas imunes e processos neuropsiquiátricos. Entre os microrganismos que compõem esse ecossistema, o gênero Enterococcus. A partir disso, a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) se apresenta como ferramenta promissora para detecção sensível e específica de microrganismos intestinais, permitindo a padronização de métodos para análises qualitativas e quantitativas da microbiota. OBJETIVOS: Neste projeto, o objetivo geral foi o desenvolvimento de um sistema baseado em PCR em tempo real para a detecção e quantificação do gênero Enterococcus sp., componente da microbiota intestinal. Os objetivos específicos foram a busca e análise das sequências nucleotídicas in sílico; o desenho de um par de oligonucleotídeos específicos para Enterococcus sp.; a construção um controle positivo plasmidial sintético; a padronização das condições do sistema de amplificação por PCR convencional; a padronização das condições do sistema de amplificação por PCR em tempo real; e a determinação da sensibilidade do sistema por PCR em tempo real. MATERIAIS E MÉTODO: Foram coletadas sequências do gene 16S rRNA de 13 espécies de Enterococcus no GenBank. Após alinhamento por ClustalW e geração de sequência-consenso pelo BioEdit, primers foram desenhados com auxílio da ferramenta OligoAnalyzer. Um controle plasmidial sintético foi desenvolvido a partir da sequência-alvo inserida no vetor PUC57. A PCR convencional foi utilizada para determinar a temperatura ótima de hibridação dos primers. Posteriormente, o sistema foi validado por qPCR em termociclador Rotor-Gene Q-Series, utilizando SYBR Gree. Foram realizadas curvas de dissociação para análise de especificidade e curvas padrão para avaliação da sensibilidade. RESULTADOS: Os oligonucleotídeos iniciadores específicos para Enterococcus apresentaram temperatura de dissociação (Tm) de 83 °C. O sistema demonstrou alta especificidade ao amplificar exclusivamente as sequências do controle positivo plasmidial. CONSIDERAÇÕES FINAIS: A padronização do sistema de qPCR para Enterococcus demonstrou-se eficiente, sensível e específico, sendo capaz de detectar esse gênero bacteriano em amostras clínicas com alta confiabilidade. O método desenvolvido poderá ser utilizado em futuras investigações clínicas envolvendo a análise do microbioma intestinal

PALAVRAS-CHAVE: Oligonucleotídeos iniciadores; Enterococcus sp.; PCR em tempo real.