PADRONIZAÇÃO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS INICIADORES PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE LACTOBACILLUS SP. POR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE EM TEMPO REAL

INTRODUÇÃO: A microbiota intestinal desempenha papel central na manutenção da homeostase e na modulação de diversas funções fisiológicas, incluindo respostas imunes e processos neuropsiquiátricos. Entre os microrganismos que compõem esse ecossistema, o gênero Lactobacillus, pertencente ao filo Firmicutes, tem se destacado por seu potencial probiótico e capacidade de influenciar a produção de neurotransmissores como a serotonina. A compreensão do papel de Lactobacillus no eixo cérebro-intestino é fundamental, especialmente em distúrbios como o Transtorno de Déficit de Atenção com Hiperatividade (TDAH), cuja etiologia multifatorial inclui a participação da microbiota intestinal. Nesse contexto, a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) se apresenta como ferramenta promissora para detecção sensível e específica de microrganismos intestinais, permitindo a padronização de métodos para análises qualitativas e quantitativas da microbiota. OBJETIVOS: O objetivo geral foi desenvolver e padronizar um sistema baseado em qPCR para detecção e quantificação do gênero Lactobacillus. Os objetivos específicos incluíram: análise in silico de sequências nucleotídicas do gene 16S rRNA de espécies do gênero; desenho de primers específicos; construção de controle positivo plasmidial; padronização da PCR convencional e em tempo real; e avaliação da sensibilidade analítica do sistema. MATERIAIS E MÉTODO: Foram coletadas sequências do gene 16S rRNA de 18 espécies de Lactobacillus no GenBank. Após alinhamento por ClustalW e geração de sequência-consenso pelo BioEdit, primers foram desenhados com auxílio da ferramenta OligoAnalyzer. Um controle plasmidial sintético foi desenvolvido a partir da sequência-alvo inserida no vetor pUC57. A PCR convencional foi utilizada para determinar a temperatura ótima de hibridação dos primers. Posteriormente, o sistema foi validado por qPCR em termociclador Rotor-Gene Q-Series, utilizando SYBR Green, utilizando amostras fecais humanas de indivíduos com e sem TDAH. Foram realizadas curvas de dissociação para análise de especificidade e curvas padrão para avaliação da sensibilidade. RESULTADOS: Os primers específicos para Lactobacillus geraram amplicons de 111 pb com temperatura de dissociação (Tm) de 81,5 °C. Na análise de amostras clínicas, o gênero Lactobacillus foi detectado em 6,7% (1/15) das amostras do grupo com TDAH e em 0% do grupo controle. Esses achados sugerem uma maior prevalência de Lactobacillus em indivíduos com TDAH, embora a frequência absoluta tenha sido baixa. CONSIDERAÇÕES FINAIS: A padronização do sistema de qPCR para Lactobacillus demonstrou-se eficiente, sensível e específico, sendo capaz de detectar esse gênero bacteriano em amostras clínicas com alta confiabilidade. Os resultados preliminares sugerem uma possível associação entre o aumento de Lactobacillus e a presença de TDAH, corroborando hipóteses sobre a participação da microbiota intestinal na fisiopatologia de transtornos neuropsiquiátricos. O método desenvolvido poderá ser utilizado em futuras investigações clínicas envolvendo disbiose intestinal e saúde mental.

PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus; Microbiota Intestinal; Qpcr; Disbiose; Eixo Cérebro-Intestino-Microbiota.