INVESTIGAÇÃO DE EFEITOS OFF-TARGET DE AMPLICONS DE SHORT HAIRPIN RNA (SHRNA) E SMALL INTERFERENCE RNA (SIRNA) EM EXPERIMENTOS BASEADOS EM TERAPIA GÊNICA QUE UTILIZAM A TÉCNICA DE RNA DE INTERFERÊNCIA (RNAI)

INTRODUÇÃO: A interferência por RNA (RNAi) é uma estratégia de silenciamento pós-transcricional baseada em siRNA/shRNA, mas sua aplicação enfrenta limitações por efeitos off-target mediados, entre outros fatores, pela região seed, conteúdo GC, formação de estruturas secundárias e imunostimulação (p.ex., motivos UGU/UGUGU/GUCCUUCAA). Este projeto combina revisão sistemática de regras de design com validação experimental para reduzir off-targets e aumentar a eficiência do knockdown em células cerebrais para estudos de genótipo-fenótipo celular. OBJETIVOS: Desenvolver e validar experimentalmente um algoritmo para design/validação de siRNA/shRNA com controle de efeitos off-target. MATERIAIS E MÉTODO: (i) Consolidação de regras clássicas de design (Ui-Tei, Reynolds, Amarzguioui e afins) e implementação em Python de filtros para preferência 5’/3’, janela ótima de GC, exclusão de palíndromos/motivos imunogênicos e mapeamento de off-targets por similaridade.(ii) Seleção de sondas comerciais para ATF4 e VAPB com documentação de Tm, GC e predição de estrutura.(iii) Diferenciação de iPSC em células progenitoras neurais (NPCs) e padronização de indução de ATF4 com tunicamicina (1–10 µg/mL; ~8 h).(iv) Otimização de transfecção comparando Lipofectamine 2000 vs 3000, variando proporções siRNA:reagente; avaliação de knockdown por qPCR (GAPDH/ATF4) e citotoxicidade. RESULTADOS: Os dados preliminares desta pesquisa indicam resultados promissores. Para validação do algoritmo desenvolvido, foram priorizados quatro genes candidatos (ATF4, ATF4, VAPB, VAPB), com documentação físico-química e de efeitos off-targets previamente mapeados, incluindo dados das sequências e parâmetros bioquímicos (p.ex., Tm/GC), os quais foram consolidados para uso experimental. Para a validação experimental, foram utilizadas células de NPCs (neural progenitor cells) derivadas de linhagens celulares H9 e S5, as quais foram cultivadas e preparadas para os ensaios de silenciamento de mRNA. Na etapa de otimização da transfecção celular, foi utilizada Lipofectamine (3000), a qual mostrou baixa eficiência de knockdown de GAPDH e maior toxicidade, inviabilizando seu uso no sistema. Em contraste, Lipofectamine (2000) apresentou silenciamento robusto e específico, com condição ótima em 2,0 μL + 40 pmol de siRNA. Complementarmente, o siRNA scrambled não alterou a expressão de GAPDH, corroborando baixa inespecificidade e baixa toxicidade do protocolo. CONSIDERAÇÕES FINAIS: O pipeline regras computacionais e os resultados preliminares de validação experimental em NPCs mostrou-se viável e já definiu uma condição de transfecção reprodutível (Lipo2000 2,0 μL/40 pmol). As próximas etapas incluem testar o knockdowns dos genes candidatos da pesquisa, além de realizar RNA-seq para mapear alvos e também potenciais efeitos off-targets dos genes de interesse da pesquisa, e também consolidar a acurácia do software para detecção e controle de off-targets.

PALAVRAS-CHAVE: Algoritmo; Efeitos off-target; Silenciamento gênico; Lipofectamine 2000; Expressão de proteínas.