DESIGN E OTIMIZAÇÃO DA QUANTIFICAÇÃO DE EXPRESSÃO GÊNICA DO PACAP POR QRT-PCR BASEADO EM SYBR®GREEN PARA ESTUDOS EM PACIENTES COM MIGRÂNEA

Introdução: A migrânea é uma condição neurológica crônica e debilitante, caracterizada por crises recorrentes de dor de cabeça associadas a sintomas como fotofobia, fonofobia e náuseas. Sua fisiopatologia envolve a ativação do sistema trigeminovascular e a liberação de neuropeptídeos, como o PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide), relacionado à sensibilização trigeminal e à vasodilatação. Estudos apontam o PACAP como um mediador central na dor migranosa, sendo considerado um potencial alvo terapêutico. Objetivos: Desenvolver e otimizar um protocolo de quantificação da expressão gênica do PACAP, por meio da técnica de qRT-PCR utilizando SYBR® Green, em amostras de pacientes com e sem migrânea. Entre os objetivos específicos, destacam-se o desenho e validação de primers, análise in sílico de seus alvos, padronização da reação e aplicação da metodologia em amostras biológicas humanas. Materiais e método: O gene ADCYAP1, codificador do PACAP, foi identificado e analisado a partir de bancos de dados genéticos (NCBI). Utilizando ferramentas como Primer-BLAST, DINAmelt e MFOLD, foram desenhados e validados primers específicos. O RNA foi extraído e obtido de 48 amostras sanguíneas (28 controles e 20 pacientes com migrânea), seguido por síntese de cDNA. A reação de qRT-PCR foi padronizada com o gene constitutivo GAPDH como controle interno, sendo realizadas curvas de melting, curvas padrão e testes de diluição para garantir especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade da técnica. Resultados: O protocolo desenvolvido é tecnicamente robusto. Os primers apresentaram alta especificidade e não houve amplificação inespecífica. A concentração ideal de cDNA foi 1:2, e a melhor concentração de primers foi 250 nM. A média dos valores de Ct para o gene PACAP foi 19,29 nos pacientes com migrânea e 22,79 nos controles (p=0,06), não sendo estatisticamente significativa. No entanto, observou-se uma grande variabilidade entre os pacientes com migrânea: seis apresentaram expressão elevada do gene PACAP, enquanto os demais mostraram expressão reduzida. Isso sugere a existência de subgrupos fenotípicos distintos entre os indivíduos com migrânea. Considerações finais: O trabalho demonstrou que a metodologia de qRT-PCR baseada em SYBR® Green para o gene PACAP é viável, sensível e reprodutível. Apesar da ausência de diferença estatisticamente significativa entre os grupos, a variabilidade na expressão do PACAP entre os pacientes com migrânea indica a possibilidade de perfis fisiopatológicos distintos. Esses achados reforçam o potencial do PACAP como alvo terapêutico e biomarcador molecular, especialmente se associado a uma estratificação clínica mais precisa. Futuros estudos com maior amostragem e dados clínicos detalhados são recomendados para validar os resultados e contribuir para a personalização do tratamento da migrânea.

Palavras-chave: Migrânea; PACAP; Expressão gênica; Qrt-pcr.