DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE SALMONELLA E KLEBSIELLA EM AMOSTRAS FECAIS HUMANAS

INTRODUÇÃO: O complexo Klebsiella pneumoniae (KpSC) engloba bacilos Gram-negativos encapsulados oportunistas da família Enterobacteriaceae que atuam como comensais da microbiota oral e intestinal humana. Contudo, a ruptura da homeostase e o estabelecimento de disbiose podem favorecer a prevalência de cepas patogênicas e a proliferação de linhagens multirresistentes (MDR) e produtoras de carbapenemases (KPC), constituindo ameaça crítica em ambientes hospitalares. A detecção rápida, sensível e específica desses microrganismos diretamente de matrizes biológicas complexas é essencial para o monitoramento clínico e profilaxia de surtos. OBJETIVOS: Desenhar um par de oligonucleotídeos específicos direcionados à região intergênica zur-khe (ZKIR) do KpSC e padronizar um ensaio de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) baseado no uso do corante intercalante SYBR Green. MATERIAIS E MÉTODO: Para o desenho in silico, foram obtidas 100 sequências da região ZKIR no GenBank, representativas de espécies do complexo (K. pneumoniae, K. quasipneumoniae, K. variicola e K. africana). Após alinhamento no ClustalW, foi deduzida uma sequência-consenso para o delineamento dos iniciadores via ferramenta PrimerQuest Tool (IDT®), priorizando similaridade de temperatura de hibridação, ausência de estruturas secundárias e alta especificidade e sensibilidade discriminatória perante outros bacilos entéricos. RESULTADOS: A especificidade foi confirmada via análise no BLAST/NCBI. O DNA genômico purificado da cepa padrão Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 por extração fenol-clorofórmio foi utilizado para a confecção do controle positivo. A padronização inicial ocorreu em PCR convencional em volume de 20 µL sob gradiente de hibridação. Na qPCR, realizada em Rotor-Gene Q-series 5PLEX-HRM (Qiagen) em volume final de 20 µL com kit QuantiNova SYBR Green PCR (Qiagen), 1 µM de cada iniciador e curva padrão com diluição seriada de base 10 (10^5 a 10^(-1) cópias/µL), estabeleceu-se a temperatura de hibridação em 58 °C e perfil de 45 ciclos. A análise da curva de dissociação revelou pico de melting único a 79,0 ± 0,5 °C (78,5°C – 79,5°C), confirmando especificidade sem produtos inespecíficos ou dímeros. A curva padrão exibiu alta linearidade (R^2=0,980), eficiência de amplificação de 108% e limite mínimo de detecção analítica de 10 cópias do alvo por reação. CONSIDERAÇÕES FINAIS: o método molecular padronizado direcionado à região ZKIR consolida-se como uma ferramenta de baixo custo, alta sensibilidade e elevada especificidade para a identificação e quantificação do complexo Klebsiella pneumoniae, com vasto potencial de aplicação no diagnóstico microbiológico e no monitoramento de disbioses.

PALAVRAS-CHAVE: Microbiota intestinal; Disbiose; Amplificação in vitro, região ZKIR.